您好,歡迎來到上海研謹生物科技有限公司!
13585717991
021-65232515
miRNA cDNA*鏈合成試劑盒說明書
miRNA cDNA Kit
miRNA cDNA*鏈合成試劑盒
目錄號:YJ2141
保存條件:-20℃保存。
組分說明
Cat. No. YJ2141
Kit Size 25 次
1mM Tris,PH8.0 1 ml
E. coli Poly(A) Polymerase(5U/μl) 15 μl
10×Poly(A) Polymerase Buffer 80 μl
10mM ATP 15 μl
25μM RT primer 90 μl
5×RT Buffer 120 μl
超純dNTPs(10mM each) 30 μl
SuperRT Reverse Transcriptase 15 μl
RNase-Free Water 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
本試劑盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly(A)尾,之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應,zui終合成miRNA對應
的*鏈cDNA。
miRNA cDNA*鏈合成試劑盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修飾過程及修飾后逆
轉錄過程需要的全部試劑。該試劑盒具有非常高的 Poly(A)修飾和逆轉錄效率,可以從
1 ng-2 μg的total RNA中有效獲得miRNA對應的cDNA*鏈。并且操作簡便、快捷,
可以用于從一個反應合成的cDNA中同時檢測多種miRNA,不僅減少了誤差、節(jié)約了樣
品,同時還實現(xiàn)了檢測的高通量。
備注:本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒(YJ2142)配套使用。
自備實驗材料:1 ng-2 μg的總 RNA,或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。
注意事項
預防RNase污染,應注意以下幾方面:
1.使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。
2.玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡
10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。
3.配制溶液應使用無RNase的水。
4.操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。
操作步驟
A.miRNA加Poly(A)尾的過程:
1.首先根據(jù)所用RNA的量,按如下公式,用1 mM Tris(PH8.0)來稀釋10 mM ATP:
ATP稀釋系數(shù)=5000/__ng的總RNA
例:如果總RNA的起始用量為100 ng,那么ATP稀釋系數(shù)=5000/100=50。即將ATP
稀釋50倍(1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris,PH8.0)。
2.向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入以下試劑至總體積25 μl。
試劑 體積 終濃度
total RNA* X μl 可達2 μg
10×Poly(A) Polymerase Buffer 2.5 μl 1×
第“1"步中稀釋好的ATP 1 μl —
E. coli Poly(A) Polymerase(5U/μl) 0.5 μl 2.5 U
RNase-Free Water up to 25 μl —
*反應中使用的total RNA必須含有小分子RNA。
此過程也可以直接使用小分子RNA(建議加入量為2-5 μl。請根據(jù)目的miRNA的豐
度來確定加入量)。
3.輕輕混勻上述反應液,短暫離心將液體收集于管底。37℃,孵育15分鐘。此過程結
束后,立刻進行*鏈cDNA的合成,或于-20℃暫存。如需長期保存,建議存放于
-80℃。
B.修飾后的miRNA cDNA*鏈合成的過程:
1.向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入下表中試劑,至終體積20 μl:
試劑 體積
上述Poly(A)反應液 4 μl
超純dNTPs(10mM each) 1 μl
25μM RT primer 3 μl
5×RT Buffer 4 μl
SuperRT Reverse Transcriptase 0.5 μl
RNase-Free Water 7.5 μl
2.輕輕混勻上述反應液,短暫離心將液體收集于管底。42℃,孵育50分鐘。
3.85℃,孵育5分鐘,終止反應。合成的 cDNA反應液可以直接進行熒光定量檢測實
驗,也可以于-20℃保存?zhèn)溆谩?/SPAN>
相關產(chǎn)品信息
目錄號 產(chǎn)品名稱
YJ0627 miRNA提取試劑盒
YJ2141 miRNA cDNA*鏈合成試劑盒
YJ2142 miRNA熒光定量 PCR檢測試劑盒