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產(chǎn)品目錄
EASYspin 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒
更新時間:2021-11-29 點擊量:2201

EASYspin 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒

EASYspin RNA Rapid Tissue and cell Kit



保存條件:本試劑盒在室溫儲存 12 個月不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹:

*的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞 RNA 酶,然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)

合條件后,RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜, 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物,蛋白等雜質(zhì)去除,后低鹽的 RNase free H20 將純凈 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

自備試劑:乙醇, β-巰基乙醇注意事項:

1.需要自備一次性注射器,研缽。RA105 EASYspin  組織 細(xì)胞RNA快速提取試劑盒-MBI2.裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套,免沾染皮膚,眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時,要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

3.關(guān)于DNA 的微量殘留:

一般說來任何總RNA 提取試劑在提取過程中無法*避免DNA 的微量殘留,本公司的EASYspin 系列RNA 提取產(chǎn)品,在大多數(shù) RT-PCR 擴(kuò)增過程中極其微量的DNA 殘留一般電泳 EB 染色紫外燈下觀察不可見)影響不是很大, 如果要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA 表達(dá)量分析如熒光定量 PCR,我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時:

1) 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過 mRNA 中的連接區(qū),這樣 DNA 就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

2) 選擇基因組DNA cDNA 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。


操作步驟:

提示:

次使用前請先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入量無水乙醇! 操作前在裂解液RLT 中加入β-巰基乙醇至終濃度 1%,如 1 ml RLT  中加入 10μl β-巰基乙醇。此裂解液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RLT 4℃可放置一個月。

1. 組織培養(yǎng)細(xì)胞

a. 收集<107 懸浮細(xì)胞到一個 1.5ml 離心管,對于貼壁細(xì)胞,孔板培養(yǎng)可以直接裂解, 細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。

b. 2,000rpm 離心 10 sec或者 300g 離心 5 min,使細(xì)胞沉淀下來。*吸棄上清,留下細(xì)胞團(tuán),注意不*棄上清會稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。

c. 輕彈管壁將細(xì)胞沉淀*松散重懸, 加入 350μl<5x106 細(xì)胞 或者 600μl5x106-1x107 細(xì)胞)裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩 20 sec,充分裂解。

d. 用帶鈍針頭的一次性 1ml(0.9mm 針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

e. 操作步驟項下 3。

2. 動物組織(例如鼠肝腦)

a. 電動勻漿: 新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊, 加入 350μl(<20mg 組織) 或者600μl(20-30mg 組織)的裂解液RLT 后電動*勻漿 20-40 sec

b. 液氮研磨+勻漿:在液氮中研磨組織成細(xì)粉后,取適量組織細(xì)粉(20mg/30mg)轉(zhuǎn)入 裝有 350μl/600μl 組織裂解液 RLT 1.5ml 離心管中,  用手劇烈振蕩 20 sec,充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(0.9mm 針頭)  注射器抽打裂解物 10  次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30 sec),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

c. 將勻漿后裂解物 12,000rpm 離心3 min,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物,將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個新離心管。

d. 操作步驟項下 3。

3. 較估計裂解物(上清)體積,加入等體積的 70%乙醇(請先檢查是否已加入無水乙醇!,此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

4. 立刻將混合物(每次小于 700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱 RA 中,吸附柱放入收集管中)12,000rpm 離心 60 sec,棄掉廢液。

5. 350μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 30 sec,12,000rpm 離心 30 sec,棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。

6. DNaseI 工作液的配制:取 10μl DNaseI 儲存液放入新的 RNase-free 離心管中,加入70μl RDD 溶液,輕柔混勻。

7. 向吸附柱 RA 中央加入 80μl DNaseI 工作液,室溫放置 15 min一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果,如果室溫效果不佳可選擇在 37℃放置 15 min。

8. 350μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 30 sec,12000rpm 離心 30 sec,棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。

9. 加入 500μl 漂洗液 RW(請先檢查是否已加入無水乙醇!,12,000rpm  離心 30 sec,棄掉廢液。加入 500μl 漂洗液 RW,重復(fù)一遍。

10. 將吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000rpm 離心 2 min,將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11. 取出吸附柱 RA,放入一個 RNase free 離心管中,根據(jù)預(yù)期 RNA 產(chǎn)量在吸附膜的中間部位30-50μl RNase free water  事先在65℃水浴中加熱效果更好,室溫放置1 min

12,000rpm 離心 1 min。


SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)次高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

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